四环冻干机—生物制品和生物组织冻干技术（六）

更新时间：2023-04-27 点击次数：577

5.3

皮肤的冻干

冻干皮肤在医学上的临床应用研究始于20世纪50年代。动物皮肤的冻干目的是用于对药物经皮肤渗透性的研究。由于透皮吸收给药新型的问世，药物经皮渗透性的研究正成为开发这类新型筛选药物的重要手段，由于大量长时间动物皮的需求，实际应用时常将待用皮放在冰箱里，可保存1周左右。时间再长，不但影响药理实验的稳定性，而且皮肤将变质。为增长皮肤保存期，可将动物皮肤冻干保存；人类皮肤冻干的目的是用于再植，为烧伤或外伤皮肤的病人植皮。

5.3.1 大鼠皮肤冻干工艺及药物渗透性实验

东北大学的郑文利博士早在20世纪末就进行了大鼠皮肤冻干的实验研究。取活大鼠脱颈处死后，立即用电动去毛刀去其腹部鼠毛，剥离皮肤，除去皮下脂肪层、血管及残留物，用蒸馏水冲洗干净，制成不同尺寸的皮片，再用生理盐水冲洗数次备用。将制备好的大鼠皮放在速率降温仪中，以-5℃/min、-l5℃/min、-30℃/min三种不同速率降温至-30℃。将三种不同降温速率预冻的大鼠皮，分别放入小型冻干机中抽真空，30min后压力稳定在120Pa,不主动加热，连续干燥34h后关机，充氮气后取出，用无菌塑料袋封装后，放在干燥器内保存。

将以不同预冻速率冻干的大鼠皮肤，经10%福尔马林固定，石蜡包埋制片，进行病理切片，切片厚度4～5μm,HE染色，再显微镜观察。新鲜大鼠皮组织切片如图5-8所示，以5℃/min速率预冻并冻干大鼠皮组织切片如图5-9所示。从图中可以看出冻干皮组织与新鲜皮组织相本相同，未见细胞破裂、上皮脱离、组织褶皱、细胞变性和细胞间隙增宽等异常，说明冻干皮组织结构未发生变化。其他速率预冻并冻干后的结果基本一致。

冻干大鼠皮角质细胞间隙脂流动性的电子自旋共振(ESR)测定：选用5-噁唑氮氧自由基硬质酸(5-DSA)作为自旋转标记物，将新鲜的和三种不同预冻速率的冻干大鼠皮角质层样品泡在浓度为1×10-4mol/L 的5-DSA缓冲液(pH=7.4)中12h，保温20℃，然后取出淋洗干净，37℃烘箱干燥1h，分别放进电子自旋共振波谱仪样品管内，再置于腔中。ESR测定条件：扫描宽度200G，接收增益3.2×104，时间常数20.48ms，微波功率5.02mW，扫描时间83.888s，调制频率 25.000kHz，调制幅度0.947G。经ESR波谱分析得知，三种不同冻结速率预冻的冻干大鼠皮与新鲜大鼠皮各系数相比无显著差异，说明冻干大鼠皮肤未引起表皮细胞间脂质结构的变化，大鼠表皮角质细胞间脂质排列的有序性没有改变，流动性没有增加。

实验采用尼莫地平为模型药物（一种脑血管扩张药），选用预冻速率为l5℃/min的冻干大鼠皮和新鲜大鼠皮做药物渗透性实验，考察其组织结构有无变化。实验采用装置为V-lia-chien水平扩散池。它是由两个等容积的玻璃半池组成，半池内径为l.35cm，有效扩散面积为 1.43cm2，容积为10mL。半池上方开口为取样口，池底有凹陷平台，起到固定搅拌的作用。实验时将皮肤固定在扩散池的两个半池之间，角质层面向供体池。水化1h后，供体池加入10mL尼莫地平的 30%丙二醇水过饱和溶液，接受池中加入10mL的30%丙二醇水，置于32℃温水浴中，磁力搅拌，定时取样并更换全部接收介质。样品经徽孔滤膜(0.45nm)过滤，续滤液，样品进人高效液相测定。尼莫地平外含量测定采用高效液相色谱法紫外检测。色谱条件：色谱柱 Spherisorb46mm×25cm，检测波长237nm，流动相是甲醇/水 (64/36)，流速为1.1mL/min，进样量10μL。实验结果如表5-11所示。

表5-11正常皮肤和冻干皮肤对尼莫地平渗透量比较

表5-11中的数据表明，在渗透9、10h、12h时，冻干皮肤与正常皮肤对药物尼莫地的渗透量无显若性差异。可见，冻干的大鼠皮肤能够满足药理的实验要求，可用做透皮制的实验研究，可以长期贮存备用。

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