冻干保护剂 ▏蛋白冻干保护剂在冷冻干燥过程中起到作用

       四环冷冻干燥机广泛用于制备治疗性蛋白质制剂，蛋白冻干制剂可以提供更好的保质期，方便药物的储藏和运输。然而，蛋白在冻干过程中存在许多应力，包括低温应力、冻结应力(枝状冰晶的形成、离子强度的增加、pH值的改变、相分离等)、干燥应力(失去蛋白质表面水分子)等，这些应力常常直接或间接导致蛋白质类药物失去天然构象从而变性或失活。所以即使采用了冷冻干燥这种温和的干燥方式，还需要加入合适的冻干保护剂以很好的保护蛋白稳定性。

       冷冻干燥保护剂对于蛋白质的保护原理已经被研究讨论了几十年，形成了一些被普遍接受的共识。如在冻结阶段，主要的假说为“优先化作用”;在干燥阶段主要的有2种假说，即“玻璃化”和“水置换”。

      冷冻干燥保护剂的分类方式很多，有文献中提出了一个公式化模型，按照功能把冷冻干燥保护剂分类，包括5类: ①pH缓冲剂，如Tris、组氨酸、枸橼酸等;②配体，可以优化蛋白质的热力学稳定性;③稳定剂，一般是双糖，如蔗糖、海藻糖等，可通过抑制蛋白质的展开和提供玻璃基质起保护作用;④非离子表面活性剂，可减少蛋白质的聚集;⑤填充剂，如甘露醇、甘氨酸、羟乙基淀粉、血清白蛋白等，可提高产品的物理成型性。这里我们简要介绍其中几种。

      为了保证冷冻干燥后形成良好的配方结构防止产品塌陷，同时改善配方溶解性，冷冻干燥保护剂中还需要加入填充剂。首先，填充剂在复溶时应该是充分可溶的并且与制剂中的蛋白质药物相容。此外，它们没有毒性问题并且具有高共晶/共熔温度(Teu)，可有效提高冷冻干燥效率。

        甘氨酸和甘露醇经常用作冻干蛋白质制剂的填充剂。甘氨酸在用作填充剂时具有优势，因为它是无毒的。它具有高共晶/共熔温度(Teu)，可实现高效冷冻干燥和高溶解度。

      甘露醇具有与甘氨酸相同的优点，并且对特定蛋白质药物如LDH和转化生长因子-b1具有稳定作用，其稳定效果取决于其浓度。因此，在选择填充剂时，应仔细考虑稳定效果以及粉饼外观。大多数氨基酸容易结晶并且可以潜在地用作填充剂以稳定蛋白质，然而，酸盐的形成阻碍了它们的结晶。 NaCl是另一种结晶剂，但其共熔温度(Teu)相对于其他填充剂的而言太低，因此不推荐使用。

      对于填充剂，应考虑退火步骤。甘氨酸和甘露糖醇在冷冻干燥过程中应以结晶形式存在。 但是在冷冻步骤期间，过冷却诱导两种填充剂以无定形形态冻结，容易导致粉饼塌陷。另外，在没有退火的情况下，填充剂可以在初级干燥期间重结晶造成西林瓶破裂，特别是当制剂中包含高浓度的甘露醇时。填充剂应在非晶相的玻璃化转变温度(Tg’)和填充剂的共熔温度(Teu)之间进行有效结晶，而退火时间取决于填充剂浓度及其性质。 对于甘露醇和甘氨酸，填充高度在1cm时，推荐在-20或-25℃和2小时。

      多元醇广泛用于蛋白质稳定剂，因为它们可以通过其羟基稳定蛋白质。多元醇已被用作冷冻保护剂和冻干保护剂。例如，在冻融期间，LDH在不同程度上受甘油，木糖醇，山梨糖醇和甘露醇的保护。

      聚合物已被用作蛋白质溶液和冻干制剂的保护剂。血清白蛋白是用于蛋白质药物开发的广泛使用的聚合物之一，作为冻干保护剂和冷冻保护剂。许多上市蛋白质药物含有不同量的白蛋白(表1)。但是，血清白蛋白具有与血源性病原体相关的潜在污染物，限制了其在蛋白质药物制剂中的使用。因此，建议rHA替代血清白蛋白。终，建议在没有白蛋白的情况下开发蛋白质药物。

      在冷冻步骤中，形成冰水界面可能导致蛋白质表面变性。表面活性剂降低蛋白质溶液的表面张力，保护其免受表面变性。广泛使用的表面活性剂之一是Tween 80。